Etude des propriétés préventives du stress oxydant, de l’inflammation et évaluation de l’activité anti-proliférative des extraits aqueux de Ochna schweinfurthiana et Anthocleista schweinfurthii sur les cellules métastasiques du sein.

Abstract

Au Cameroun, 80 % des cas de cancer du sein sont diagnostiqués à la phase terminale de la maladie. Dans cette phase, le stress oxydant et l’inflammation chronique produisent des composants qui induisent l’altération du matériel génétique et activent les voies de signalisations cellulaires dans l’épithélium des cellules mammaires. Ceci accentue la carcinogenèse qui inclut la prolifération et la dissémination des cellules cancéreuses dans l’organisme. Le présent travail vise à évaluer les propriétés préventives du stress oxydant, de l’inflammation et l’activité antiproliférative des extraits aqueux de O. schweinfurthiana et A. schweinfurthii sur les cellules métastasiques du sein. Le profil phytochimique des extraits aqueux de O. Schweinfurthiana et A. schweinfurthii a été déterminé par la méthode standard et par la procédure LC/MS. Les polyphénols totaux ont été dosés en utilisant le réactif de Folin-Ciocalteu. L’évaluation de l’activité antioxydante in vitro des extraits aqueux de O. schweinfurthiana et A. schweinfurthii a été effectué par les méthodes de DPPH, ABTS, FRAP et β-carotène. Concernant l’évaluation de l’activité antioxydant in vivo, elle a été effectuée sur 28 rats : soit 7 lots de 4 rats. Le témoin négatif a été traité avec l’eau distillée ; le stress oxydatif a été induit aux six autres lots par administration orale d’1 mL/Kg de H2O2 dans l’huile de maïs (1:5 v/v) par gavage à l’aide d’une sonde gastrique, parmi lesquels 2 ont servi de lots expérimentaux et ont été traités avec 100 mg/kg et 250 mg/kg des extraits des écorces de O. schweinfurthiana (OSE) et A. schweinfurthii (ASE), 50 mg/Kg pour le lot référence traité avec l’Acide ascorbique et le dernier lot témoin positif, après induction du stress oxydant, aucun traitement n’a été administré à ce dernier. Vingt quatre heures après l’administration de la dernière dose, tous les animaux ont été anesthésiés par administration intramusculaire de Kétamine (50 mg/kg) + Diazépam (10 mg/kg). Le sang a été prélevé sur la patte postérieure et mis dans différents tubes (EDTA et sec) ; ensuite les animaux ont été sacrifiés. Pour l’obtention du plasma, le sang a été prélevé dans les tubes EDTA, après centrifugation à 3000 tr/min pendant 15 minutes avec une centrifugeuse de marque centrifuge 90-1, le plasma qui est le surnageant a été recueilli puis conservé dans les eppendorf à -20 °C. L’activité antioxydante in vivo a été évaluée par les tests de réduction du fer par le plasma sanguin, le dosage de l’activité de la catalase et le dosage de l’activité de la superoxyde dismutase. L’activité anti-inflammatoire des extraits des deux plantes a été determinée à l’aide des méthodes in vitro d’inhibition de la 15-lipoxygenase par le test du Ferrous oxidation-xylenol orange (FOX), l’inhibition de la dénaturation des protéines par le test de BSA et le test d’inhibition de la protéinase. Ensuite l’évaluation in vitro de la génotoxicité des extraits sur les souches Salmonella thyphimurium TA98 et TA100 par la méthode de Ames. L’évaluation de la cytotoxicité des extraits et des fractions sur les cellules MCF-7, MDA-MB-361 et sur la cellule Véro par la méthode de réduction du MTT. L’isolement des composés ont été réalisés par la chromatographie sur colonne et CCM. L’identification a été réalisée grâce à la procédure LC/MS et la base de données Scifinder. Les représentations graphiques ont été obtenues en utilisant le Tableur Windows Microsoft Excel 2013 et le logiciel Graphpad/Prism 7. Les analyses statistiques ont été effectuées en utilisant le logiciel SPSS 23. et Graphpad/Prism 7 à p<0,05. Les résultats obtenus montrent que les extraits de O. schweinfurthiana et A. schweinfurthii sont constitués de nombreuses familles de composés telles que a révélé la présence de nombreux métabolites secondaires tels que les alcaloïdes, stéroïdes, tanins catéchiques, flavonoïdes, saponines et triterpènes. Grâce à la LC/MS, L’hemerocallone ; le 6,7-dimethoxy-3’-4’-dimethoxyisoflavone ; la lithhospermoside ; l’amentoflavone ; l'agathisflavone ; le β-D-fructofuranosyl-α-D-glucopyranoside ont été isolés et identifiés de l’extrait aqueux des écorces de O. schweinfurthiana. Deux composés ont été isolés et identifiés des extraits aqueux des écorces d’A. schweinfurthii, le 3-isocyanato-8-(4-pyridinyl) [1,2,4] triazolo [4,3-b] pyridazine et le biphényltriol. Quatre autres composés ont été identifiés des extraits aqueux des écorces d’A. schweinfurthii, il s’agit de la 3',5,7-trihydroxy-4'- méthoxyflavanone ; le 8-[1-azépanyl)-2propanyl]2-)3-méthyl)-1,3,8 triazaspiro[4,5]déc-1-én- 4-one ; ainsi que la 3,8-dihydroxy-6méthyl-9,10dioxo-9,10-dihydro-1-anthrancényl-β-D glucopyranoside et la soscoparine. Le dosage des antioxydants révèle que les extraits aqueux des écorces des deux plantes possèdent la plus forte teneur en polyphénols. Ces extraits sont constitués majoritairement des antioxydants secondaires avec des teneurs respectives de 681,91 ± 25,68 mg EAA/g extrait et 537±32 mg EAA/g extrait respectivement pour les extraits aqueux des écorces de A. schweinfurthii et O. schweinfurthiana. Concernant l’activité antioxydante in vitro, les extraits aqueux des écorces d’A. schweinfurthii et d’O. schweinfurthiana possèdent la meilleure activité antiradicalaire in vitro avec le test de DPPH et ABTS. Ces extraits possèdent une activité antiradicalaire statistiquement identique avec des pouvoirs antiradicalaires respectifs 0,3±0,03 de 0,23±0,02 avec le test de DPPH, avec le test d’ABTS, l’extrait aqueux des écorces d’O. schweinfurthiana avec un PA de 27,496±0,51 possède une activité antiradicalaire statistiquement supérieure à celle de l’extrait aqueux des écorces d’A. schweinfurthii dont le PA est de 23,542±1,203. Les extraits aqueux des écorces d’O. schweinfurthiana et d’A. schweinfurthii possèdent la meilleure activité réductrice. L’extrait aqueux des écorces d’A. schweinfurthii dans le test de FRAP, avec un pouvoir réducteur de 0,185±0,003 mg EAA/g extrait possède une activité réductrice statistiquement identique (P>0,05) à celle des extraits aqueux des écorces d’O schweinfurthiana dont le pouvoir réducteur est de 0,191±0,011 mg EAA/g extrait. Par contre, dans le test du β-carotène, l’extrait aqueux des écorces d’A. schweinfurthii avec un pouvoir réducteur de 3,251±0,015 mg EAA/g extrait possède une activité réductrice statistiquement supérieure (P<0,05) à celle des extraits aqueux des écorces d’O. schweinfurthiana avec un pouvoir réducteur de 2,541± 0,003 mg EAA/g extrait. Pour ce qui concerne l’activité antioxydante in vivo, l’extrait aqueux des écorces d’A. schweinfurthii testé à 250 mg/kg poids corporel (pc) possède un pouvoir réducteur de 0,167±0,001 mg/mL statistiquement supérieur (P<0,05) à celui des différents l’extraits testés. Les résultats du dosage de la catalase et de la superoxyde dismutase montre que les extraits aqueux des écorces de O. schweinfurthiana et A. schweinfurthii à la dose 100 mg/kg sont efficaces pour piéger les radicaux libres et prévenir le stress oxydant. Les résultats des tests anti-inflammatoires obtenus montrent que les extraits aqueux des écorces de O. schweinfurthiana et A. schweinfurthii ont une bonne activité inhibitrice de la 15-lipoxygenase avec les IC50 respectives de 32,19±0,36 µg/mL et 37,19±0,54 µg/mL. En ce qui concerne l’inhibition de la protéinase, l’extrait aqueux des écorces d’O. schweinfurthiana a montré une forte activité inhibitrice de la protéinase avec une IC50 de 75,63 ± 0,75 µg/mL. L’extrait aqueux des écorces de A. schweinfurthii a une forte activité inhibitrice de la dénaturation du BSA avec une IC50 de 13,67 ± 0,88 µg/mL. Les extraits aqueux des écorces d’A. schweinfurthii et d’O. schweinfurthiana sont non génotoxiques. Concernant le test de cytotoxicité sur les cellules MCF-7, MDA-MB-361 et Véro, la fraction A et la fraction B ont présenté une cytotoxicité sélective sur la cellule MCF- 7 avec respectivement des LC50 de 2,502±0,001 µg/mL et 3,23±0,002 µg/mL. L’extrait aqueux des écorces d’A. schweinfurthii a montré une cytotoxicité sélective sur la cellule MDA-MB-361 avec une LC50 de 12,5±1,2 µg/mL. Tous les échantillons testés étaient non-cytotoxiques sur les cellules Véro. Six composés de structure connues ont été isolés et identifiés des fractions actives de O. schweinfurthiana et deux composés de structure connues ont été isolés et identifiés de la fraction obtenue à partir de l’extrait aqueux des écorces de A. schweinfurthii. Ainsi, ces extraits constituent des traitements complémentaires à la chimiothérapie ciblée contre la prolifération des cellules mammaires cancéreuses et les molécules isolées et identifiées constitueraient des potentiels agents anti-cancéreux.