Investigating the molecular basis and underlying biochemical mechanisms of CYP325A as a pyrethroid resistance gene in Anopheles funestus, a major malaria vector across Africa

Abstract

La surexpression et la suractivité des gènes clés du cytochrome P450 (CYP450) sont les principaux moteurs de la résistance métabolique aux insecticides chez les vecteurs africains du paludisme tels que Anopheles funestus s.s. De précédentes analyses de transcription basées sur RNAseq ont révélé une expression élevée de CYP325A spécifique aux populations d'Afrique centrale, mais son rôle dans la résistance n'a pas été démontré auparavant. Cette étude a utilisé un large éventail de techniques de biologie moléculaire pour effectuer la caractérisation moléculaire (essais biologiques insecticides, PCR et clonage ) et validation fonctionnelle du CYP325A en tant que gène de résistance aux pyréthroïdes par prédiction in silico (modélisation d'homologie et simulations d'amarrage moléculaire), in vitro (expression hétérologue dans E. coli et essais de métabolisme ou de déplétion avec des insecticides) et in vivo (expression transgénique chez les mouches et interférence ARN dans les techniques de validation chez les moustiques). Dans cette étude, la RT-qPCR a systématiquement confirmé que le CYP325A est fortement surexprimé chez An. funestus résistant aux pyréthrinoïdes du Cameroun, par rapport à une souche témoin et à des moustiques non exposés aux insecticides. Avec le PBO, sensibilité récupérée pour la perméthrine et la deltaméthrine indiquant une résistance métabolique basée sur le P450. Les analyses de la séquence codante du CYP325A à l'échelle de l'Afrique ont détecté des niveaux élevés de polymorphisme, mais sans allèles prédominants sélectionnés par la résistance aux pyréthroïdes. Des modifications géographiques des acides aminés ont été détectées notamment au Cameroun. Des expériences in silico ont prédit que le CYP325A se lie et métabolise les pyréthroïdes de type I et de type II. L'expression hétérologue du CYP325A recombinant et les tests métaboliques ont confirmé que l'haplotype camerounais le plus courant métabolise les pyréthrinoïdes de type I et de type II avec un taux de déplétion deux fois supérieur à celui de l'haplotype de la RD Congo. L'analyse du promoteur putatif de 1 kb du CYP325A a révélé une diversité réduite chez les moustiques résistants par rapport aux moustiques sensibles, suggérant un balayage sélectif potentiel dans cette région. Des essais in vivo avec des mouches transgéniques et des interférences ARN ont confirmé la tendance impliquant le CYP325A dans la résistance aux pyréthroïdes. L'établissement du CYP325A en tant que gène métabolisant la résistance aux pyréthrinoïdes explique en outre la résistance aux pyréthrinoïdes dans les populations centrafricaines d'An. funeste. Notre travail facilitera les efforts futurs pour détecter les marqueurs de résistance causals dans la région promotrice du CYP325A afin de concevoir des outils de diagnostic basés sur l'ADN applicables sur le terrain et de conseiller les décideurs sur le choix des outils de lutte antivectorielle.