Bio-guided Isolation of the in vitro anti-leishmanial active natural products from Diospyros grascilesens L. (Ebenaceae) and Rothmania hispida K. Schum (Rubiaceae).

Abstract

La leishmaniose est une maladie parasitaire tropicale négligée causée par les espèces appartenant au genre leishmania et transmise par la piqure du phlébotome femelle infecté. Cette maladie constitue un véritable problème de santé publique avec d’énormes conséquences sur les plans social et économique. Le traitement de la leishmaniose est limité par de nombreux facteurs tels que: la non-disponibilité des médicaments, leur cout élevé, de nombreux effets secondaires enregistrés, leur toxicité et l’émergence des phénomènes de résistance de plus en plus rencontrés. De plus, en l’absence d’un vaccin éfficace, il devient important de rechercher de nouveaux principes actifs comme point de départ de nouveaux médicaments pour lutter contre cette maladie, l’objectif de ce travail était focalisé sur l’activité antileishmaniale in vitro bio-guidée des extraits bruts de D. gracilescens et R. hispida, ciblant les formes extracellulaire (promastigotes) et intracellulaire (amastigotes) de L. donovani. Les différents extraits de plantes ont été préparés par macération utilisant un mélange eau- éthanol (H O: EtOH) (30:70, v/v) et Chlorure de methylène-methanol (CH Cl -MeOH) (1:1, v/v). Par

la suite, les extraits bruts les plus actifs ont été fractionnés en utilisant la partition liquide-liquide et la chromatographie sur colonne comme approches. Différentes concentrations des extraits bruts et fractions (100 ; 20 ; 4 ; 0.8 and 0.16 μg/mL), et des composés isolés (50, 10 ; 2 ; 0.4 and 0.08 μg/mL) de D. gracilescens et R. hispida ont été testés in vitro sur les formes promastigotes et intracellulaires amastigotes de L. donovani (1S (MHOM/SD/62/1S). L’activité antileishmaniale a été effectuée par la méthode colorimétrique utilisant la résazurine. Le test de cytotoxicité a été effectué sur la lignée cellulaire des macrophages RAW 264.7 par la méthode colorimétrique utilisant la résazurine. Les tests d’invasion et d’immunomodulation, la cinétique de mortalité, l’étude des interactions des deux (02) composés les plus actifs entre eux et avec le médicament de référence, l’activité anti-oxydante des composés les plus actifs de même que la toxicité aigüe de l’extrait brut le plus actif ont aussi été investigués. Les résultats obtenus ont montré que l’extrait brut hydroethanolique du tronc de D. gracilescens et l’extrait brut au mélange CH Cl -MeOH des tiges de R. hispida ont été les les plus

actifs sur les formes promastigotes de L. donovani avec des valeurs de Concentrations Inhibitrices 50 (CI50) respectives de 5.84 et 5.74 µg/mL. Le fractionnement bio-guidé de l’extrait brut du tronc de D. gracilescens a permis l’obtention de quatre (04) fractions parmi lesquelles, la fraction à l’hexane qui s’est révélée comme étant la plus active (CI50 = 0.789 µg/ml). La purification des fractions les plus actives a conduit à l’isolement de six (06) composés qui ont présenté une activité modérée comparée à celle de la fraction à l’hexane (CI50 = 5.50-38.75 µg/mL). Le lupeol, le mélange β- sitosterol/stigmasterol ont été isolés de la fraction hexanique, la betuline et l’acide bétulinique de la fraction au dichloromethane tandis que le β-sitosterol glucoside et le 1-deoxyinositol ont été isolés de la fraction au n-butanol. Le fractionnement bioguidé de l’extrait des tiges de R. hispida a donné trois (03) fractions dont, la fraction à l’hexane s’est revélée la plus active avec une CI50 de 4.38 µg/ml. La purification des fractions actives conduit à l’isolement de neuf (09) composés parmi lesquels, l’acide ursolique a présenté la meilleure activité avec une CI50 de 0.75 µg/ml. Le mélange stigmasterol-β-sitosterol, lichexanthone, le mélange uvaol et erythrodiol, les acides docosanoique, ursolique et oleanolique ont été isolés de la fraction à l’hexane tandis que le 3-O-β-D-sitosterolglycoside de la fraction à l’acétate d’éthyle. La fraction à l’hexane provenant de D. gracilescens, les acides ursolique et oléanolique isolés des R. hispida ont tous montré des indices de sélectivité (IS) supérieures à 18 (IS>18). Le test d’immunomodulation a montré un taux ce production élévé d’oxyde nitrique dans les macrophages traités par les acides ursolique et olénolique suggérant ainsi que ces composés pourraient etre impliqués dans le mécanisme de mort des amastigotes intracellaulaires du parasite Leishmania. Le test d’invasion a montré que la CI50 a été diminuée lors que l’acide ursolique a été ajouté avant infection des macrophages suggérant ainsi que ce composé pourrait agir comme un agent préventif, ceci à travers l’inhibition de l’infection des macrophages par les promastigotes métacycliques du parasite Leishmania. La plupart des composés isolés de D. gracilescens étaient faiblement actifs et non-sélectifs (IS<1) comparés aux composés isolés de R. hispida qui ont été tous actifs et sélectifs. La fraction à l’hexane de D. gracilescens, les acides ursolique et oléanolique ont montré un potentiel significativement inhibiteur sur la croissance des promastigotes de L. donovani, mais aucun effet sur l’inhibition totale n’a été observé sur une période de 120 heures. Le test d’interaction des 2 composés les plus actifs entre eux et avec le médicament de référence l’amphotéricine B, a montré un effet synergique sur les formes promastigotes et intracellulaires amastigotes du parasite leishmania. Les acides ursolique et oléanique ont montré une bonne capacité de piégeage du radical DPPH et un fort potentiel dans l’activité chélatrice du fer. Le test de toxicité aigüe de l’extrait brut des tiges de R. hispida a montré que la Dose Létale 50 (DL50) est supérieure à 2000 mg/kg. Les résultats obtenus dans cette étude ont montré que la fraction à l’hexane du tronc de D. gracilescens, les acide ursolique et oléanolique isolés des tiges de R. hispida ont montré un grand potentiel inhibiteur sur les formes promastigotes et intracellulaires amastigotes du parasite L. donovani. La plupart des composés isolés de D. gracilescens étaient faiblement actifs et non-sélectifsxxxi (IS<1) comparés aux composés isolés de R. hispida qui ont été tous actifs et sélectifs. Toutefois, des études futures portant sur la relation structure-activité pourrait conduire à l’obtention de dérivés d’intérêts plus actifs qui pourront ainsi servir comme point de départ pour la découverte de nouveaux médicaments contre la leishmaniose viscérale.